НАУКА и ОБРАЗОВАНИЕ

УДК 57.087

Введение

В современной онкоцитологии при исследовании материала пункционных биопсий врач-цитолог опирается на качественные признаки, которые носят субъективный характер, поэтому возникают значительные трудности при установлении характера процесса. Так, в настоящее время достоверность цитологического исследования при опухолях и опухолеподобных заболеваниях почек колеблется от 76,4 до 91,3 %. Кроме того, пункция почки является одной из самых сложных, о чем свидетельствует высокий процент неудавшихся пункций (до 11,5 %) [1]. Наибольшие диагностические трудности возникают при дифференциальной цитологической диагностике между реактивными изменениями почечного эпителия (РИ), ангиомиолипомой (АМЛ), и высокодифференцированным почечно-клеточным раком (ВДПКР) [2, 3]. Изображения препаратов, соответствующие наиболее характерной цитологической картине при норме (Н), а также указанных состояниях, приведены на рисунке 1 а-г (препараты предоставлены лабораторией онкоцитологии МНИОИ им. П.А. Герцена).

Рис. 1. Изображения цитологических препаратов почки при

а) норме, б) реактивных изменениях, в) доброкачественных изменениях, г) злокачественных изменениях

В сложных случаях для проведения дифференциальной цитологической диагностики используют окраску азотнокислым серебром (AgNOR), при которой визуализируется внутренняя структура ядер клеток, что позволяет оценить метаболическую и пролиферативную активность клеток. Однако для данного типа окраски в настоящее время не выделены классы ядер клеток, что затрудняет формализацию и объективизацию исследования данных цитологических препаратов [2 -5]. Для повышения эффективности цитологической диагностики опухолей и опухолеподобных заболеваний почек необходимо формализовать численное описание геометрических и текстурных характеристик ядер, алгоритм оценки вероятности диагноза из группы рассматриваемых.

Комплекс морфологических характеристик ядер

Геометрические характеристики ядер. Анализ морфологии ядер клеток почечного эпителия [5] показал, что для оценки морфофункционального состояния клетки, целесообразно ввести следующие геометрические характеристики ядер:

1)      Нормированная площадь ядра:

где  – максимальное значение площади, полученное при обучении алгоритма.

2)      Коэффициент округлости ядра:

где  – периметр ядра.

При стремлении данного коэффициента к 1, форма предмета стремиться к кругу, то есть чем более округлую форму будет иметь анализируемое ядро, тем больший коэффициент  ей будет соответствовать.

3)      Коэффициент неровности контура ядра:      

Чем меньше этот коэффициент, тем более ровный контур у исследуемого ядра.

Текстурные характеристики ядер. Для оценки морфофункционального состояния клетки, целесообразно использовать следующие текстурные характеристики ядер: равномерность хроматина, количество и размер ядрышек [3, 5].

Для суммарной оценки этих текстурных характеристик был выбран метод матрицы градиентов. Данный метод заключается в построении матрицы, характеризующей вероятность  встречаемости пар точек с яркостями  и  на изображении, находящихся в заданном направлении, определяемом углом  = 0, 45, 90, 135, на заданном расстоянии  друг от друга. Вычисленная таким образом матрица является квадратной, размера , где  – число уровней яркости изображения. В качестве характеристик текстуры используются параметры, вычисляемые по матрице градиентов [5, 6]:

1)      Контраст

2)      Корреляция

3)      Энергия

4)      Гомогенность

По каждой матрице градиентов вычисляются оценки четырех описанных выше параметров. Для устранения эффекта смещения оценок за счет изменения ориентации клеток на изображениях вычисляются средние значения и максимальный разброс значений параметров в зависимости от угла  для каждого расстояния . В ходе предварительных исследований было установлено, что текстурные характеристики целесообразно рассчитывать для нескольких значений расстояний  = {5; 7}, что обусловлено размерами ядерных структур на регистрируемых изображения.

Для формирования классов ядер в пространстве признаков необходимо решить задачу кластеризации их в данном пространстве; поэтому на основе сформированного вектора параметров, включившего в себя три геометрических параметра и 16 текстурных, проводилась кластеризация ядер алгоритмом c-средних [6]. В качестве целевой функции данный алгоритм использует сумму квадратов взвешенных отклонений от центров искомых кластеров.

Для определения числа морфофункциональных типов ядер клеток почечного эпителия проводилась оценка качества кластеризации по 2 критериям:

1)      Степень однородности кластеров:

где,

 – максимальное количество ядер i-ото кластера, принадлежащее какому-либо одному верифицированному диагнозу,

 – общее число анализируемых ядер.

Степень однородности кластеров характеризует наличие в выделенных кластерах ядер, относящихся к разным диагнозам. Значение степени однородности кластера тем выше, чем больше число ядер в кластере, принадлежащих к одному верифицированному диагнозу

2)      Степень компактности кластеров:

где  – средняя максимальная степень принадлежности ядра к какому-либо кластеру.

Данный коэффициент равен 0, если  , то есть ядро принадлежит всем кластером с одинаковой вероятностью.

Алгоритм вычислительной диагностики

Обобщение результатов классификации отдельных ядер в препарате и вынесение заключения о характере наблюдаемых изменений является задачей вычислительной диагностики (ВД). Вероятностная теория Байеса анализирует вероятности появления отдельных признаков при определенных заболеваниях, относящихся к рассматриваемой группе [7]. Совокупность признаков (S₁, S₂,… S_p), где p – количество ядер на исследуемом препарате, представляет собой номера кластеров, в которые классифицированы ядра. Далее совокупность признаков S_i будем обозначать S. В качестве рассматриваемых диагнозов при дифференциальной диагностике ПКР рассматриваются следующие: D1 – Н, D2 – РИ, D3 – АМЛ, D4 – ВДПКР.

В соответствии с формулой Байеса выражение для апостериорной вероятности P(D_j/S) диагноза D_j при наблюдении признаков S имеет вид:

где P(Dj) – априорная вероятность диагноза Dj;

P(S/Dj) – условная вероятность признаков S, т.е. вероятность того, что в случае, если Dj  имеет место, то будут обнаружены признаки S;

k– число рассматриваемых диагнозов, k=4.

Сделаем допущение об условной независимости отдельных признаков, т.е., в исследуемом случае, о независимости результатов классификации отдельных ядер с изображения препарата между собой на подмножествах каждого из диагнозов [7]. Введение такого допущения может быть оправдано тем фактом, что материал одной цитологической пробы может содержать ядра, относящиеся к разным классам. Это допущение позволяет выразить совместную вероятность через произведение условных вероятностей каждого из признаков в отдельности:

,

где L– количество кластеров;

C_l – l-й кластер;

p_l– число ядер, принадлежащих кластеру C_l;

 – условная вероятность того, что при данном диагнозе D_j ядро будет отнесено в кластер С_l.

Таким образом, в предположении равенства априорных вероятностей диагнозов, расчет апостериорной вероятности каждого из диагноза проводится по в соответствии с соотношением:

Условные вероятности  оцениваются по обучающей выборке как доля всех ядер, полученных с препаратов с диагнозом D_j, принадлежащих кластеру C_l:

где mlj – число ядер, принадлежащих кластеру C_l, и присутствующих на препаратах соответствующих диагнозу Dj;

Nj – общее количество ядер,  присутствующих на препаратах соответствующих диагнозу Dj в обучающей выборке.

Решение о рекомендуемом диагнозе D_j принимается по максимуму апостериорной вероятности.

Для определения числа морфофункциональных типов ядер клеток почечного эпителия был проведен их кластерный анализ в сформированном пространстве признаков. Кластеризация проводилась для 120 сегментированных вручную ядер, количество кластеров варьировалось от 4 до 8. Результаты кластеризации оценивались по 2 предложенным критериям, в качестве наилучшего результата кластеризации был выбран случай 5 кластеров (таблица 1), для которого , .

Таблица 1. Результаты кластеризации для 5 кластеров

Из таблицы 1 видно, что каждому верифицированному диагнозу соответствует свой морфофункциональный тип ядер клеток. Для АМЛ их выявлено два. Это соответствует медицинским данным о наличии в пробах АМЛ не только ядер эпителиальных клеток, но и ядер миобластов.

Определение качества ВД заболеваний почки проводилось на группе контроля из 30 верифицированных цитологических препаратов. Результаты сравнения верифицированных диагнозов с результатами работы алгоритма ВД представлены в таблице 2.

Таблица 2. Сравнение верифицированных диагнозов с результатами ВД

Для 30 препаратов было получено 26 совпадений верифицированного диагноза и результатов ВД (таблица 2), что составляет 86,7%, полученное значение приближается к вероятности постановки правильного диагноза квалифицированным врачом-цитологом.

Выводы

Проведен анализ морфологических параметров ядер клеток почечного эпителия на цитологических препаратах, окрашенных азотнокислым серебром; сформирован комплекс характеристик, включающий три геометрических (площадь, округлость, неровность контура) и 16 текстурных признаков изображений ядер. Текстурные характеристики оцениваются по четырем параметрам полутоновой матрицы градиентов изображения (контраст, корреляция, энергия и гомогенность), для каждого из которых вычисляется среднее значение параметра по четырем направлениям и его максимальный разброс; указанные характеристики вычисляются для двух расстояний между пикселями d=5, 7.

Решена задача формализации морфофункциональных типов ядер. С использованием метода кластеризации с-средних и предложенных в работе критериев оценки качества кластеризации определено число морфофункциональных типов ядер и их численные характеристики. Установлено, что для четырех диагнозов (норма, реактивные изменения, ангиомиолипома, высокодифференцированный почечно-клеточный рак) число морфофункциональных типов равно 5.

Предложен алгоритм вычислительной диагностики, использующий формулу Байеса для расчета апостериорных вероятностей диагнозов из группы рассматриваемых по результатам классификации ядер в цитологическом препарате на сформированные морфофункциональные типы.

В результате экспериментальных исследований на 30 верифицированных препаратах ядер клеток почечного эпителия установлено, что вероятность постановки правильного диагноза составляет 86,7%, что соответствует результатам визуального анализа высококвалифицированным врачом-цитологом.

Созданные в ходе выполнения работы система вычислительной диагностики, методы и алгоритмы анализа изображений цитологических препаратов почечного эпителия могут быть использованы для повышения объективности, снижения трудоемкости цитологического анализа в онкоцитологии, способствовать широкому его распространению в клинико-диагностической практике.

Представленные результаты получены при проведении НИР в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы, ГК № П2276 от 13.11.2009 г. и при поддержке гранта РФФИ 10-08-01310-а.

Литература

1.      Злокачественные новообразования в России в 2008 году (заболеваемость и смертность) Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. – М.: ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Росздрава, 2010. – 256 с.

2. Значение аргентофильных белков областей ядрышковых организаторов в цитологической диагностике рака почки /Волченко Н.Н., Мельникова В.Ю., Спиридонов И.Н. и др. //Российский онкологический журнал. – 2007. – №5. – С.37-39.
3. Определение активности областей ядрышковых организаторов при реактивных изменениях почечного эпителия и высокодифференцированном почечно-клеточном раке /Мельникова В.Ю., Спиридонов И.Н., Самородов А.В., Славнова Е.Н. //Современные микроскопические исследования в биологии и медицине: Сб. статей – М.: Лабора, 2006. – С. 153-155.
4. Экспрессия аргирофильных белков ядрышкого организатора как показатель степени зрелости доброкачественных и злокачественных опухолей надпочечника /Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Баронин А.А. и др. //Архив патологии. – 2002. – № 3. – С.26-30.
5. Количественный анализ цитологических изображений почечного эпителия в онкологии /Самородов А. В., Полянская М. Г., Славнова Е. Н. и др. //Биомедицинская радиоэлектроника. – 2007. – №10. – С.21 – 27.

6.      Гонсалес Р., Вудс Р. Цифровая обработка изображений. — М.: Техносфера, 2005. – 1072 с.

7. Спиридонов И.Н., Самородов А.В. Методы и алгоритмы вычислительной диагностики: Учеб. пособие. – М.: Изд-во МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2006. – 50 с.